钟梅芳 马秋林 李楚凌 卢炫廷
缝隙连接蛋白基因GJB2是导致常染色体隐性遗传非综合征型聋的最常见原因[1]。其中，GJB2基因c.109G>A/p.Val37Ile(以下简称p.V37I)变异位点，不仅在很多耳聋患者中被检测出来，也存在于听力正常的个体中。它广泛存在于东亚人群中，在我国广东省人群中的等位基因频率高达11.61%[2]。p.V37I的耳聋致病性一直备受争议，但目前已被美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(ACMG/AMP)指南明确划分为耳聋致病变异位点[3]。由于p.V37I相关的听力表型具有不完全外显和变异度较大的特点，对经典的孟德尔遗传病在临床解释上提出了重大挑战[1]。目前，关于GJB2 p.V37I致病变异最普遍存在的广东人群中的听力表型信息报道比较少，本研究通过对广东东莞地区210例携带GJB2基因p.V37I纯合及复合杂合变异婴儿的听力筛查、诊断及随访结果进行总结和分析，获得其听力表型信息，以进一步了解和评价GJB2 p.V37I基因变异对东莞地区儿童听力损失的影响，为临床耳聋基因诊断与遗传咨询提供参考。
1.1研究对象 以2018年1月至2021年1月期间，来自东莞地区20家医院出生的且耳聋基因筛查或测序结果为GJB2基因p.V37I纯合或复合杂合变异，并均在东莞市新生儿听力障碍诊治中心接受耳聋遗传咨询和听力检测的婴儿210例为研究对象,临床听力学资料完整,其中男115例，女95例；
东莞市户籍123例，省内非本市户籍24例，外省户籍63例；
出生时有听力损失高危因素46例，其中25例有病理性黄疸(未达到换血治疗程度)，早产儿5例，新生儿肺炎4例，足月小样儿3例，宫内感染3例，羊水吸入综合征3例，3例出生时因母亲孕期合并心脏病、重度子痫和脓毒血症入住新生儿监护病房，其余164例为出生正常婴儿。
1.2耳聋基因检测方法 210例出生后均接受了耳聋基因筛查，其中204例(97.14%，204/210)出生后接受了听力联合耳聋基因同步筛查，其余6例是在1岁以内听力学诊断异常后进行了耳聋基因筛查及测序。Sanger测序检测是使用广东凯普生物科技股份有限公司的聚合酶链式反应技术(PCR)对GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12SrRNA的4个基因的目标位置进行扩增，并采用特异性引物进行检测。引物见表1，特异性引物的设计是专门针对目标位点，并覆盖该位点上下游的序列。对标本检测得到的序列与NCBI所提供的上述4个基因参考序列，使用生物信息学软件Alamut Visual 2.11进行比对和注释。对突变的表述参照HGVS (Human Genome Variation Society) version 15.11进行。
表1 检测GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA 12SrRNA 4个基因的PCR引物
1.3听力检测方法 根据相关指南[4]，对出生后2～3天的新生儿在出生医院采用耳声发射(OAE)或自动听性脑干反应(AABR)完成听力初筛；
初筛未通过者于出生后42天内转诊至东莞市新生儿听力障碍诊治中心进行复筛，采用畸变产物耳声发射(DPOAE)和AABR联合测试；
复筛未通过者于3月龄进行第一次听力诊断，使用气导听性脑干反应(ABR)+声导抗+DPOAE+行为测听的基本组合听力测试；
首次听力诊断异常者于6月龄进行第二次听力诊断，根据患儿听力损失的情况在基本组合听力测试项目上追加骨导ABR和听性稳态反应(ASSR)测试等，具体测试设备与参数设置见文献报道[5]。所有研究对象的基本信息与听力筛查诊断结果均录入东莞市新生儿听力筛查系统，以便对患儿的跟踪随访和数据的统计分析。
1.4听力诊断标准 参考相关文献[6]，将婴儿听力诊断正常标准定为：①气导短声ABR波V反应阈<35 dB nHL；
②1 000 Hz探测音鼓室导抗图为正峰型；
③DPOAE测试有≥5个频率点的信噪比≥6 dB，且幅值在正常范围内；
④行为测听听阈参考对应月龄的正常值。依照ABR波V反应阈值，将听力损失程度划分为四个等级：轻度(31～50 dB nHL)、中度(51～70 dB nHL) 、重度(71～90 dB nHL)和极重度听力损失(≥91 dB nHL)。
1.5统计学方法 采用统计学软件SPSS 20.0对所得数据进行分析，计量资料以频数(n)或百分率(%)表示，两组的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1耳聋基因检测结果 210例婴儿中，194例(92.38%，194/210)为GJB2基因p.V37I纯合变异，15例(7.14%，15/210)为GJB2基因p.V37I/c.235delC复合杂合变异，1例为GJB2基因p.V37I/c.79G>A/ c.23C>T的3位点复合杂合变异。
2.2听力检测结果
2.2.1听力初筛及复筛结果 210例中，初筛未通过166例(79.05%，166/210),其中146例进行了听力复筛，未通过共84例(57.14%，84/146)。在两步筛查中，初筛通过44例和复筛通过62例，共106例(50.48%,106/210)通过听力筛查。
2.2.2听力诊断结果 210例(420耳)中，88例进行第一次听力学诊断，66例(111耳)气导短声ABR波V反应阈>35 dB nHL和DPOAE未引出，诊断为听力异常，其中4例(4耳)耳内镜检查显示中耳腔积液征和1 000 Hz鼓室导抗图无峰型，其余婴儿1 000 Hz鼓室导抗图为有峰型。
第一次听力诊断异常的66例中55例接受了第二次听力诊断和相关医学评估，其中,43例(75耳)(17.86%,75/420)诊断为听力异常,75耳均为DPOAE未引出和1 000 Hz鼓室导抗图正峰，其中1例(2耳)ABR测试显示存在明显的骨-气导差,表现为传导性听力损失，其余均为感音神经性听力损失；
67耳(89.33%,67/75)为轻度听力损失，1例单侧和1例双侧(4%,3/75)中度听力损失，3例单侧和1例双侧(6.67%,5/75)为重度及以上听力损失。对比第一次听力诊断的结果，第二次听力诊断为轻度听力损失的人数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。
表2 66例GJB2基因p.V37I纯合及复合变异婴儿不同听力损失程度在二次听力诊断的分布(耳,%)
2.2.3听力损失较重病例的随访结果 本研究最终共检出6例(8耳)中度及以上听力损失患儿，其中2例单侧聋患儿尚未完善耳聋基因诊断及影像学评估，4例接受了Sanger测序分析和内耳MRI或颞骨CT检查，最后一次的听力随访结果如下。
病例1：男，无听力损失高危因素，听力初复筛双耳均未通过，3月龄和6月龄时，左侧气导ABR反应阈100 dB nHL未引出,右侧100 dB nHL，ASSR预估听力图(图1a)为双耳极重度感音神经性听力损失。基因筛查和Sanger测序分析为GJB2基因p.V37I纯合变异，内耳MRI平扫MRN(图2a1和2a2)示左侧前庭扩大并与水平半规管融合，右侧前庭稍扩大和半规管稍扩张，考虑先天性发育畸形。于7月龄时已行右侧人工耳蜗植入术。
病例2：女，无听力损失高危因素，听力初复筛左耳未通过，3月龄和6月龄时诊断为左耳重度感音神经性听力损失,左侧气导ABR反应阈90 dB nHL,ASSR预估听力图呈明显高频陡降型(图1b)。基因筛查和Sanger测序分析为GJB2基因p.V37I纯合变异和GJB3基因c.357C>T杂合变异，内耳MRI(图2b1和2b2)发现左侧蜗神经未显示，左侧耳蜗顶回略小。目前，该患儿未行任何听力干预。
病例3：男，无听力损失高危因素，听力初复筛双耳均未通过，3月龄和7月龄时,双侧气导ABR测试时引出声诱发短潜伏期负反应波(ASNR)，且存在约30～40 dB的气-骨导差(图1c1和1c2)，ASSR预估听力图为双耳中度听力损失(图1c3)。基因筛查和Sanger测序分析为GJB2基因p.V37I纯合变异和SLC26A4基因c.2086C>T杂合变异，颞骨CT扫描(图2c1和2c2)发现双侧大前庭水管增宽，并直接与总脚相遇，双侧耳蜗发育异常，诊断为大前庭水管综合征(LVAS)，目前双耳佩戴助听器和进行言语康复训练。
病例4：女，出生时有病理性黄疸行蓝光治疗，听力初筛左耳未通过,右耳通过，复筛双耳均未通过;1岁时左侧气导ABR反应阈55 dB nHL，右侧45 dB nHL，ASSR预估听力图为左耳中度和右耳轻度听力损失(图1d)。基因筛查和Sanger测序分析为GJB2基因p.V37I纯合突变，颞骨CT平扫+重建未见明显异常。目前，该患儿未行任何听力干预。
图1 4例患儿的听力测试图 a.患儿1的ASSR; b.患儿2的ASSR; c1.患儿3的气导ABR; c2.患儿3的骨导ABR; c3.患儿3的ASSR; d.患儿4的ASSR
图2 3例患儿的影像学图像 a1.患儿1内耳MRI平扫MRN显示左侧前庭扩大并与水平半规管融合(短箭头),右侧前庭稍扩大(长箭头); a2.患儿1右侧半规管稍扩张(长箭头); b1.患儿2 MRI斜矢状面内耳道成像显示左侧内耳道未见蜗神经(长箭头); b2.患儿2右侧内耳道蜗神经(长箭头); c1.患儿3颞骨CT扫描显示双侧前庭水管增宽(长箭头); c2.患儿3双侧前庭直接与总脚相遇(长箭头),双侧耳蜗发育异常
GJB2基因位于人类染色体13q11-12，含有2个外显子，编码的缝隙连接蛋白26(Cx26)属于完整膜蛋白的连接蛋白家族，对耳蜗支持细胞的功能至关重要。当发生DFNB1位点突变，无论是纯合或复合杂合突变，使GJB2基因的两个等位基因失活，导致常染色体隐性遗传性聋[7]。GJB2是一个小基因，但有很多突变。至今为止，已发现有200多个GJB2变异位点与常染色体隐性遗传非综合征型聋相关，其常见的突变热点往往存在明显的种族差异，而且不同突变的听力表型可能差异很大[7]。GJB2基因p.V37I刚开始被认为非致病突变[8]，然而大量研究已证实它是一个广泛存在于东亚人群的致病变异[9]，目前已获得我国药品监督管理局(NMPA)批号的耳聋基因筛查试剂盒中的变异位点[10]。
研究表明[11,12]，p.V37I变异是GJB2基因非截断突变中的错义突变，仅导致耳蜗外毛细胞微小损失或蛋白功能部分降低，但大体上不影响耳蜗细胞的结构及缝隙连接蛋白的形成与定位，故p.V37I的致病性和外显率较低。本研究发现210例GJB2基因p.V37I纯合及复合杂合变异婴儿中，有106例(50.48%，106/210)可通过两步筛查;以往研究[13-15]亦报道p.V37I纯合或复合杂合变异婴儿听力筛查通过率26.67%～53.85%，说明p.V37I变异外显率较低，尤其在新生儿听力筛查中存在一定比例的“不外显”。另外，本组对象中有22例p.V37I变异携带者两次听力筛查皆未通过但第一次听力学诊断为正常;还有12例虽然首次听力诊断为轻中度听力损失但第二次听力诊断为正常，尤其是轻度听力损失者的比例较多。推测可能由于出生后外中耳残留羊水、胎脂或发生常见的婴儿分泌性中耳炎，经过治疗或自愈后中耳功能改善从而听力好转；
也可能存在低月龄婴儿听觉功能发育迟缓，随着月龄增长听力随之改善。
p.V37I变异不仅外显率较低，且引起的听力损失主要为轻度至中度感音神经性听力损失[14-17]。本研究中，经过“两次诊断”后确诊为听力损失者43例(75耳)，检出率为17.86%(75/420)，与Chai等[18]推断p.V37I纯合突变约有17%的外显率接近。这75耳听力损失耳中，轻度听力损失67耳(89.33%，67/75)，而中度听力损失仅3耳(4%，3/75)，比既往文献报道的听力损失程度及比例要低，可能与本研究对象的地区不同及年龄较小等有关。
p.V37I变异引起的听力表型变异较大，可为听力正常，也可为轻度至极重度感音神经性听力损失，但发生严重听力损失的比例较少[18]。本研究仅发现6例(8耳)中度及以上听力损失婴儿，随访中发现3例同时携带其他基因变异或合并内耳或神经发育畸形。Del等[7]的文献综述表明GJB2基因DFNB1听力损失患者中较少出现颞骨畸形，其患病率通常低于10%。因此，考虑个别严重听力损失的p.V37I变异病例可能是由于存在其他基因变异或病因，建议进行分子遗传学和影像学等全面评估。
综上所述，本组东莞地区携带GJB2基因p.V37I纯合及复合杂合变异的婴儿中，听力损失的检出率为17.86%，听力表型外显率较低，而且变异较大。值得关注的是，已有不少文献[13，14]报道p.V37I变异与儿童迟发性和渐进性听力损失有关。因此，在临床中须重视包括p.V37I基因在内的遗传性聋易感基因筛查，对基因变异携带者即使通过听力筛查或听力正常也应注意随访，动态监测其听力。但是，由于本研究对出生后一年内婴儿的耳聋基因筛查和听力资料进行总结与分析，大多数研究对象有待进一步完善耳聋基因诊断及主观行为测听等相关检查来验证其基因型与听力表型的相关性;今后还需进行持续的听力随访，以期为临床咨询提供更准确的依据。
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